Экспериментальное исследование

Оценка мышечных изменений после внутримышечного введения ENDOPEEL

Авторы изучали изменение походки и тканевую реакцию мышцы, которой была сделана инъекция endopeels.
Мы решили вводить endopeel в предтибиальную мышцу крыс и изучать гистологические изменения.
Выбор предтибиальной мышцы крыс был сделан из‑за сходства по массе с депрессором угла рта у человека.

Цель : Изучить биологическое явление, вызванное инъекцией endopeels в предтибиальную мышцу крысы Wister и оценить изменения её походки и гистопатологические изменения в обработанной мышце.

Авторы

Основные авторы :
-Dr.Alain Tenenbaum
-Sr.Mauro Tiziani
Tomas Yung Joon Kim
Romulo Mené

Подробнее о главных авторах

01

Исследовательская
группа

Экспериментаторы : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

N= 29 крыс Wistar
Средний вес : 421 г

Происхождение животных : Biotério Central кампуса Рибейрао-Прето Университета Сан-Паулу
Содержание : экспериментальная патология Лаборатория кафедры патологии Медицинской школы Рибейрао-Прето – USP
Условия содержания : полипропиленовые коробки
Питание : стандартный лабораторный рацион и вода
Условия освещения : естественные циклы свет/тьма в контролируемых базовых условиях
Экспериментаторы : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

02

Эвтаназия животных & гистологические образцы

Конвенциональная микроскопия

Мыши были усыплены в камерах с CO2.

Разрез кожи лезвием № 23
Выделение и изоляция предтибиальной мышцы с помощью ножниц Метценбаума
Пересечение сухожилий ножницами Майо.
Фиксация участков мышцы на пробковых подложках
Включение с использованием 50% раствора формальдегида - 10% буферного и 50% чистого парафина для конвенционального оптического микроскопического исследования.
Окрашивание срезов по стандартной гистологической методике.
Микротом использовался : Leika RM 2155
Окрашивание срезов мышцы с

-гематоксилин-эозин
-трихром Массона
-и красный пикро‑сириус.

Гистологическое исследование было выполнено с помощью обычного микроскопа (Olympus BH2)
Наблюдение под поляризованной лампой
Фотодокументация была выполнена с помощью микроскопа Leika DMR, подключённого к цифровой камере Leika CD 300F и совместимому ПК.

03

Материалы

6 крыс/ящик

Животных разделили на 6 коробок, так что коробки с номерами 1–5 содержали по 5 крыс, а коробка №6 содержала 4 крысы
Все животные подвергались оценке походки по отпечаткам лап на специальной бумаге и предварительному погружению задних лап в мыльный раствор.
Коробка 1 содержала контрольную группу, которой вводили 0,1 мл физиологического раствора ( NaCl 0,9%) в правую предтибиальную мышцу.
Крысы в коробках 2–5 получали 0,1 мл Endopeels Original Main Product в ту же мышцу, что и контрольная группа.
Коробка 6 состояла из 4 крыс, и каждая из них получала 0,5 мл Endopeels original main product, введённого в подкожный слой.
Все животные проходили оценку походки до и после соответствующих инъекций.

04

Методы

Животных эвтаназируют через 10 дней - 1 месяц - 3 месяца - 7 месяцев

Оценка походки

Для регистрации отпечатков лап крыс использовали полоски бумаги размером 43 см в длину и 8,7 см в ширину — размеры, считающиеся подходящими для «дорожки» крыс и изготовленные по чертежу De MEDINACELI; FREED; WYATT (1982). Бумага предварительно замачивалась в растворе бромфенолового синего.

Для приготовления раствора бромфеноловый синий в безводной (Sigma) форме был разведён до 1% в абсолютном ацетоне, приобретя оранжевый цвет.
Листы бумаги погружали в этот раствор и сушили на солнце, затем нарезали на полоски и хранили в пластиковых пакетах, чтобы избежать влаги, которая могла бы изменить синий цвет.

Животных прогоняли по дорожке, покрытой ранее подготовленными бумажными полосками, при этом их задние лапы были погружены в раствор нейтрального детергента, который немедленно изменяет цвет отпечатка с жёлтого на синий. Отпечатки остаются на бумажных полосках, которые затем сушат для снятия необходимых измерений при расчёте Sciatic Functional Index .
Позже они анализировались компьютерной программой (software), разработанной SELLI (1998), для получения Sciatic Functional Index, предложенного BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989), который учитывает длину отпечатка, общее распространение пальцев между 1‑м и 4‑м пальцами, и промежуточные пальцы — 2‑й и 3‑й. Отпечатки каждой особи получали до введения endopeel в качестве контроля, сразу после инъекции endopeel, а затем повторно через определённые интервалы, когда животных эвтаназировали для извлечения передней большеберцовой мышцы для гистологического исследования.

Отпечатки оцифровывались сканером и загружались в программу SELLI, которая позволяет захватывать, идентифицировать и анализировать изображения, а также применять другие методы определения Sciatic Functional Index (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986), а также индексы функциональности большеберцовой кости и малоберцового нерва (BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989). Как только отпечаток отображается на мониторе, его параметры анализируются и измеряются путём установки курсора и кликов в заранее определённой последовательности. Программа затем вычисляет и выводит значение индекса, которое также сохраняется в компьютере.

Отпечатки лап мыши без инъекций

Отпечатки лап мыши после введения 0,05 мл в правую предтибиальную мышцу

Расчёт и измерение Sciatic Functional Index (SFI)

Схематическое представление измерений, выполненных для расчёта Sciatic Functional Index.

E: Экспериментальная (оперированная лапа);

N: Нормальная (противоположная лапа);

TS: Полное раскрытие пальцев (1‑й по 5‑й);

IT: Раскрытие промежуточных пальцев (2‑й по 4‑й);

PL: Длина отпечатка

Программа, использованная для измерения Sciatic Functional Index (SFI)

Анализ походки

Выводы по походке

0,9% NaCl, 0,1 мл в предтибиальную мышцу не изменяет походку.
Endopeel в дозе 0,1 мл при внутримышечном введении в предтибиальную мышцу существенно влияет на походку сразу после введения и умеренно спустя 10–30 дней.
Изменение походки, вызванное Endopeel, уменьшается со временем при внутримышечном введении на этом уровне концентрации.
Введение в подкожную ткань менее эффективно, чем внутримышечное.
При введении 0,5 мл в подкожную ткань (область предтибиальной мышцы) наблюдается прогрессирующая потеря походки, вероятно из‑за медленной диффузии Endopeel из подкожной ткани в мышечную.