Studio Sperimentale

Valutazione delle alterazioni muscolari dopo l'applicazione intramuscolare di ENDOPEEL

Gli autori hanno studiato l'alterazione dell'andatura e la reazione tissutale del muscolo che ha ricevuto un'iniezione di Endopeels.
Abbiamo scelto di applicare Endopeel nel muscolo pretibiale dei ratti e studiare le alterazioni istologiche.
La scelta del muscolo pretibiale dei ratti è stata fatta per la similarità di peso con il muscolo depressore dell'angolo della bocca nell'uomo.

Obiettivo : Studiare il fenomeno biologico causato dall'iniezione di Endopeels nel muscolo pretibiale del ratto Wister e valutare le alterazioni nella sua andatura e l'alterazione istopatologica nel muscolo trattato.

Autori

Autori principali :
-Dr.Alain Tenenbaum
-Sr.Mauro Tiziani
Tomas Yung Joon Kim
Romulo Mené

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Study
Group

Sperimentatori : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

N= 29 ratti Wistar
Peso medio : 421g

Origine degli animali : Biotério Central of Campus of Ribeirão Preto of São Paulo University
Mantenimento : Patologia Sperimentale Lab of Pathology Department on Medicine School of Ribeirão Preto – USP
Alloggiamento degli animali : gabbie in polipropilene
Alimentazione degli animali : dieta di base del laboratorio e acqua
Condizioni di illuminazione : cicli luce/buio naturali sotto condizioni di controllo di base
Sperimentatori : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

02

Sacrificio degli animali & Campioni istologici

Microscopia convenzionale

I topi sono stati eutanasizzati in camere a CO2.

Incisione della cute con una lama n. 23
Individuazione e isolamento del muscolo pretibiale usando forbici Metzenbaum
Sezionamento dei tendini con forbici Mayo.
Fissazione di porzioni dei muscoli su sezioni di sughero
Inclusione usando soluzione al 50% di formaldeide - 10% tamponata e 50% di paraffina pura per lo studio microscopico ottico convenzionale.
Colorazione delle sezioni come processo istologico di routine.
Microtomo usato : Leika RM 2155
Colorazione delle sezioni muscolari con

-ematossilina-eosina
-tricromo di Masson
-e picro-sirius rosso.

Esame istologico è stato eseguito con un microscopio convenzionale (Olympus BH2)
Osservazione con lampada polarizzata
Documentazione fotografica è stata effettuata con un microscopio Leika DMR collegato a una fotocamera digitale Leika CD 300F e PC compatibile.

03

Materiale

6 ratti/gabbia

Gli animali sono stati divisi in 6 gabbie, in modo che le gabbie da 1 a 5 avevano 5 ratti e la gabbia numero 6 aveva 4 ratti
Tutti gli animali sono stati sottoposti a una valutazione del passo mediante l'impronta del piede su carta speciale, dopo immersione preventiva degli arti posteriori in una soluzione di sapone.
Gabbia 1 ospitava il gruppo di controllo, che ha ricevuto l'applicazione di 0,1 ml di soluzione salina (NaCl 0,9%) sul muscolo pretibiale destro.
I topi delle gabbie 2 a 5 hanno ricevuto 0,1 ml di Endopeels Original Main Product sullo stesso muscolo del gruppo di controllo.
Gabbia 6 era costituita da 4 ratti, e ciascuno ha ricevuto 0,5 ml di Endopeels Original Main Product iniettati nello strato sottocutaneo.
Tutti gli animali sono stati sottoposti a valutazione del passo prima e dopo le rispettive iniezioni.

04

Metodi

Gli animali vengono sacrificati dopo 10 giorni-1 mese- 3 mesi-7 mesi

Valutazione del passo

Per registrare le impronte dei ratti, sono state utilizzate strisce di carta di 43 cm di lunghezza per 8,7 cm di larghezza, dimensioni considerate adeguate per il 'catwalk' dei ratti e costruite secondo il disegno di DE MEDINACELI; FREED; WYATT (1982). La carta è stata precedentemente immersa in una soluzione di blu di bromofenolo.

Per la preparazione della carta il blu di bromofenolo nella sua forma anidra (Sigma) è stato diluito all'1% in acetone assoluto, acquisendo un colore arancione.
Le foglie di carta sono state immerse in questa soluzione e poste al sole per asciugare, quindi tagliate in strisce e conservate in confezioni di plastica, in modo da evitare umidità, che potrebbe alterare il colore blu.

Gli animali sono stati fatti camminare sul catwalk coperto con le strisce di carta precedentemente preparate, con gli arti posteriori immersi in una soluzione di detergente neutro, che cambia immediatamente il colore dell'impronta da giallo a blu. Le impronte rimanevano sulle strisce di carta, che venivano lasciate asciugare per la lettura delle misure necessarie a calcolare l'Indice Funzionale Sciatico.
Successivamente queste sono state analizzate da un programma per computer (software) sviluppato da SELLI (1998), per ottenere l'Indice Funzionale Sciatico proposto da BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989), che tiene conto della lunghezza dell'impronta, dell'apertura totale delle dita (dalla 1ª alla 4ª), e delle dita intermedie che sono la 2ª e la 3ª. Le impronte di ogni animale sono state ottenute prima dell'applicazione di Endopeel, come controllo, immediatamente dopo l'iniezione di Endopeel, e nuovamente a intervalli periodici, quando gli animali venivano sacrificati per l'estrazione del muscolo tibiale anteriore per lo studio istologico.

Le impronte sono state digitalizzate con uno scanner e inserite nel programma SELLI, che consente la cattura, l'identificazione e l'analisi delle immagini, permettendo l'applicazione di altri metodi di identificazione dell'Indice Funzionale Sciatico (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986), così come indici di funzionalità della tibia e del nervo peroneo (BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989). Una volta che l'impronta è mostrata sul monitor, i suoi parametri vengono analizzati e misurati, richiedendo il posizionamento del cursore da cliccare nella corretta sequenza predeterminata. Il programma quindi calcola e fornisce il valore dell'indice, e questo viene anche memorizzato nel computer.

Impronte del topo senza alcuna iniezione

Impronte del topo dopo iniezione di 0,05 ml nel muscolo pretibiale destro

Calcolo e misurazione dell'Indice Funzionale Sciatico o SFI

Rappresentazione schematica delle misure realizzate per calcolare l'Indice Funzionale Sciatico.

E: Sperimentale (arto operato);

N: Normale (arto opposto);

TS: Apertura totale delle dita (1ª alla 5ª);

IT: Apertura delle dita intermedie (2ª alla 4ª);

PL: Lunghezza del passo

Programma usato per misurare l'Indice Funzionale Sciatico SFI

Analisi dell'andatura

Conclusioni sull'andatura

NaCl 0,9%, 0,1 ml nel muscolo pretibiale non altera l'andatura.
Endopeel a 0,1 ml intramuscolare pretibiale altera l'andatura in modo marcato immediatamente dopo l'applicazione e moderatamente dopo 10-30 giorni.
L'alterazione dell'andatura causata da Endopeel diminuisce nel tempo quando applicato per via intramuscolare, a questo livello di concentrazione.
L'applicazione nel tessuto sottocutaneo non è efficace come quella intramuscolare.
Quando vengono applicati 0,5 ml nel tessuto sottocutaneo (regione del muscolo pretibiale) si osserva una progressiva perdita dell'andatura, probabilmente a causa della lenta diffusione di Endopeel dal tessuto sottocutaneo a quello intramuscolare.