Estudio experimental

Evaluación de las alteraciones musculares tras la aplicación intramuscular de ENDOPEEL

Los autores estudiaron la alteración de la marcha y la reacción tisular del músculo que recibió una inyección de Endopeels.
Elegimos aplicar Endopeel en el músculo pretibial de ratas y estudiar las alteraciones histológicas.
La elección del músculo pretibial de las ratas se realizó debido a la similitud de peso con el músculo depresor de la comisura de la boca en humanos.

Objetivo : Estudiar el fenómeno biológico causado por la inyección de Endopeel en el músculo pretibial de la rata Wistar y evaluar las alteraciones en su marcha y la alteración histopatológica en el músculo aplicado.

Autores

Autores principales :
-Dr.Alain Tenenbaum
-Sr.Mauro Tiziani
Tomas Yung Joon Kim
Romulo Mené

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Grupo
de estudio

Experimentadores : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

N= 29 ratas Wistar
Peso medio : 421g

Origen de los animales : Biotério Central of Campus of Ribeirão Preto of São Paulo University
Mantenimiento : Patología Experimental Lab of Pathology Department on Medicine School of Ribeirão Preto – USP
Alojamiento de los animales : cajas de polipropileno
Alimentación de los animales : dieta básica del laboratorio y agua
Condiciones de luz : ciclos naturales de luz/obscuridad bajo condiciones básicas controladas
Experimentadores : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

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Sacrificio de animales y muestras histológicas

Microscopía convencional

Los ratones fueron sacrificados en cámaras de CO2.

Incisión de la piel con una cuchilla nº 23
Localización y aislamiento del músculo pretibial usando tijeras Metzenbaum
Sección de los tendones con tijeras Mayo.
Fijación de porciones de los músculos en secciones de corcho
Inclusión usando solución de formaldehído al 50% - 10% tamponada y 50% de parafina pura para estudio microscópico óptico convencional.
Tinción de las secciones según el proceso histológico de rutina.
Microtome used : Leika RM 2155
Coloration of muscle slices with

-hematoxilin-eosin
-Masson´s trichrome
-and red picro-sirius.

Histologic examination was realized with a conventional microscope (Olympus BH2)
Observation under polarized lampe
Photographic documentation was realized with a Leika DMR microscope joined to a digital camera Leika CD 300F and compatible PC.

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Material

6 ratas/caja

Los animales se dividieron en 6 cajas, de modo que las cajas del número 1 al 5 tenían 5 ratas y la caja número 6 tenía 4 ratas
Todos los animales fueron sometidos a una evaluación de la marcha mediante impresión de huellas en papel especial, y previa inmersión de las patas traseras en una solución jabonosa.
Caja 1 contenía el grupo control, que recibió la aplicación de 0,1 ml de solución salina ( NaCl 0,9%) en el músculo pretibial derecho.
Los animales de cajas 2 a 5 recibieron 0,1 ml del producto principal Endopeels Original en el mismo músculo que el grupo control.
Caja 6 estuvo constituida por 4 ratas, y cada una recibió 0,5 ml del producto principal Endopeels Original inyectado en la capa subcutánea.
Todos los animales fueron sometidos a evaluación de la marcha antes y después de sus respectivas inyecciones.

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Métodos

Los animales son sacrificados después de 10 días-1 mes- 3 meses-7 meses

Evaluación de la marcha

Para registrar las huellas de las ratas, se utilizaron tiras de papel de 43 cm de largo por 8,7 cm de ancho, dimensiones consideradas adecuadas para el 'catwalk' de las ratas y construidas según el dibujo de DE MEDINACELI; FREED; WYATT (1982). El papel fue previamente empapado en una solución de azul de bromofenol.

Para la preparación del papel, el azul de bromofenol en su forma anhidra (Sigma) se diluyó al 1% en acetona absoluta, adquiriendo un color anaranjado.
Las hojas de papel se empaparon en esta solución y se colocaron al sol para secar, luego se cortaron en tiras y se almacenaron en envases plásticos, con el fin de evitar la humedad, que podría alterar el color azul.

Los animales fueron obligados a caminar por la pasarela cubierta con las tiras de papel previamente preparadas, con sus patas traseras empapadas en una solución de detergente neutro, que inmediatamente cambia el color de la huella de amarillo a azul . Las huellas permanecen en las tiras de papel, que fueron dejadas a secar para la lectura de las medidas necesarias para calcular el Índice Funcional Ciático .
Posteriormente estas fueron analizadas por un programa informático (software) desarrollado por SELLI (1998) , para obtener el Índice Funcional Ciático que fue propuesto por BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989), que tiene en cuenta la longitud de la huella, la apertura total de los dedos entre el 1.º y el 4.º dedo, y los dedos intermedios que son el 2.º y 3.º. Las huellas de cada animal fueron obtenidas antes de la aplicación de Endopeel, como control, inmediatamente después de la inyección de Endopeel, y de nuevo, en intervalos periódicos, cuando los animales fueron sacrificados para la extracción del músculo tibial anterior para estudio histológico.

Las huellas fueron digitalizadas con un escáner e introducidas en el programa SELLI, que permite la captura, identificación y análisis de las imágenes, permitiendo la aplicación de otros métodos de identificación del Índice Funcional Ciático (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986), así como índices de funcionalidad tibial y del nervio peroneo (BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989). Una vez que la huella se muestra en el monitor, sus parámetros se analizan y miden, lo que requiere colocar el cursor y hacer clic en la secuencia predeterminada correcta. El programa entonces calcula y suministra el valor del índice, y este también se almacena en el ordenador.

Huellas del ratón sin ninguna inyección

Huellas del ratón después de la inyección de 0,05 ml en el músculo pretibial derecho

Cálculo y medición del Índice Funcional Ciático (SFI)

Representación esquemática de las mediciones realizadas para calcular el Índice Funcional Ciático.

E: Experimental (pie operado);

N: Normal (pie opuesto);

TS: Apertura total de los dedos (1.º al 5.º);

IT: Apertura de los dedos intermedios (2.º al 4.º);

PL: Longitud del paso

Programa utilizado para medir el Índice Funcional Ciático (SFI)

Análisis de la marcha

Conclusiones sobre la marcha

NaCl 0,9%, 0,1 ml en el músculo pretibial no altera la marcha.
Endopeel a 0,1 ml intramuscular en el pretibial afecta la marcha de forma acentuada inmediatamente después de la aplicación y moderadamente entre los 10 y 30 días.
La alteración de la marcha causada por Endopeel disminuye con el tiempo cuando se aplica por vía intramuscular, a este nivel de concentración.
La aplicación en tejido subcutáneo no es tan eficaz como la intramuscular.
Cuando se aplican 0,5 ml en el tejido subcutáneo (región del músculo pretibial) hay una pérdida progresiva de la marcha, probablemente debido a la lenta difusión de Endopeel desde el tejido subcutáneo hacia el intramuscular.