Estudo Experimental

Avaliação das alterações musculares após a aplicação intramuscular de ENDOPEEL

Os autores estudaram a alteração da marcha e a reação tecidual do músculo que recebeu uma injeção de Endopeel.
Optamos por aplicar Endopeel no músculo pré-tibial de ratos e estudar as alterações histológicas.
A escolha do músculo pré-tibial de ratos foi feita devido à semelhança de peso com o músculo depressor do canto da boca em humanos.

Objetivo : Estudar o fenômeno biológico causado pela injeção de Endopeel no músculo pré-tibial do Rato Wister e avaliar as alterações em sua marcha e a alteração histopatológica no músculo aplicado.

Autores

Autores Principais :
-Dr.Alain Tenenbaum
-Sr.Mauro Tiziani
Tomas Yung Joon Kim
Romulo Mené

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Study
Group

Experimentadores : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

N= 29 ratos Wistar
Peso médio : 421g

Origem dos animais : Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Manutenção : Patologia Experimental Laboratório do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Criação dos animais : caixas de polipropileno
Alimentação dos animais : dieta básica do laboratório e água
Condições de iluminação : ciclos naturais claro/escuro sob condições básicas controladas
Experimentadores : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

02

Sacrifício dos Animais & Amostras Histológicas

Microscopia Convencional

Os camundongos foram eutanasiados em câmaras de CO2.

Incisão da pele com lâmina nº 23
Localização e isolamento do músculo pré-tibial usando tesouras Metzenbaum
Seção dos tendões com tesoura Mayo.
Fixação de porções dos músculos em seções de cortiça
Inclusão utilizando solução de formaldeído 50% - 10% tamponada e 50% de parafina pura para estudo microscópico óptico convencional.
Coloração das lâminas como processo histológico de rotina.
Micrótomo usado : Leika RM 2155
Coloração das lâminas do músculo com

-hematoxilina-eosina
-tricrômico de Masson
-e picro-sirius vermelho.

Exame histológico foi realizado com um microscópio convencional (Olympus BH2)
Observação sob lâmpada polarizada
Documentação fotográfica foi realizada com um Leika DMR microscope acoplado a uma câmera digital Leika CD 300F e PC compatível.

03

Material

6 ratos/caixa

Os animais foram divididos em 6 caixas, de forma que as caixas de número 1 a 5 tinham 5 ratos e a caixa número 6 tinha 4 ratos
Todos os animais foram submetidos a uma avaliação da marcha por impressão das patas em papel especial, e prévia imersão dos membros posteriores em uma solução de sabão.
Caixa 1 continha o grupo controle, que recebeu a aplicação de 0,1 ml de solução salina ( NaCl 0,9%) no músculo pré-tibial direito.
Os ratos das caixas 2 a 5 receberam 0,1 ml do produto principal original Endopeels no mesmo músculo que o grupo controle.
Caixa 6 foi constituída por 4 ratos, e cada um recebeu 0,5 ml do produto principal original Endopeels injetado na camada subcutânea.
Todos os animais foram submetidos à avaliação da marcha antes e depois de suas respectivas injeções.

04

Métodos

Os animais são sacrificados após 10 dias-1 mês- 3 meses-7 meses

Avaliação da Marcha

Para registrar as pegadas dos ratos, foram usadas tiras de papel medindo 43 cm de comprimento por 8,7 cm de largura, dimensões consideradas adequadas para a 'passarela' dos ratos e construídas conforme o desenho de DE MEDINACELI; FREED; WYATT (1982). O papel foi previamente embebido em uma solução de bromofenol azul.

Para a preparação do papel o bromofenol azul em sua forma anidro (Sigma) foi diluído a 1% em acetona absoluta, adquirindo uma cor laranja.
As folhas de papel foram embebidas nessa solução e colocadas ao sol para secar, depois foram cortadas em tiras e armazenadas em embalagens plásticas, de modo a evitar umidade, o que poderia alterar a cor azul.

Os animais foram levados a caminhar na passarela coberta com as tiras de papel previamente preparadas, com os membros posteriores imersos em uma solução de detergente neutro, que imediatamente altera a cor da pegada de amarela para azul . As pegadas permanecem nas tiras de papel, que foram deixadas para secar para a leitura das medidas necessárias para calcular o Índice Funcional do Ciático .
Posteriormente estas foram analisadas por um programa de computador (software) desenvolvido por SELLI (1998) , para obter o Índice Funcional do Ciático que foi proposto por BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989), que leva em conta o comprimento da impressão, a abertura total dos dedos entre o 1º e o 4º dedo, e os dedos intermediários que são o 2º e 3º. As pegadas de cada animal foram obtidas antes da aplicação do Endopeel, como controle, e imediatamente após a injeção de Endopeel, e novamente, em intervalos periódicos, quando os animais foram sacrificados para a extração do músculo tibial anterior para estudo histológico.

As pegadas foram digitalizadas com um scanner e inseridas no programa SELLI, que permite a captura, identificação e análise das imagens, possibilitando a aplicação de outros métodos de identificação do Índice Funcional do Ciático (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986), bem como índices de funcionalidade da tíbia e do nervo fibular (BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989). Uma vez que a pegada é mostrada no monitor, seus parâmetros são analisados e medidos, o que requer o posicionamento do cursor para clicar na sequência predeterminada correta. O programa então calcula e fornece o valor do índice, e este também é armazenado no computador.

Pegadas do camundongo sem nenhuma injeção

Pegadas do camundongo após injeção de 0,05 ml no músculo pré-tibial direito

Cálculo e Medição do Índice Funcional do Ciático (SFI)

Representação esquemática das medidas realizadas para calcular o Índice Funcional do Ciático.

E: Experimental (pata operada);

N: Normal (pata oposta);

TS: Abertura total dos dedos (1º ao 5º);

IT: Abertura dos dedos intermediários (2º ao 4º);

PL: Comprimento da passada

Programa usado para medir o Índice Funcional do Ciático (SFI)

Análise da Marcha

Conclusões sobre a Marcha

NaCl 0,9%, 0,1 ml no músculo pré-tibial não altera a marcha.
Endopeel a 0,1 ml intramuscular pré-tibial afeta acentuadamente a marcha, imediatamente após a aplicação & moderadamente após 10 a 30 dias.
A alteração na marcha causada pelo Endopeel diminui com o tempo quando aplicado via intramuscular, neste nível de concentração.
A aplicação no tecido subcutâneo não é tão eficiente quanto a intramuscular.
Quando 0,5 ml é aplicado no tecido subcutâneo (região do músculo pré-tibial) há uma perda progressiva da marcha, provavelmente devido à lenta difusão do Endopeel do tecido subcutâneo para o intramuscular.