Zum Hauptinhalt springen

Experimentelle Studie 

Beurteilung der Muskelveränderungen nach intramuskulärer Anwendung von ENDOPEEL

Die Autoren untersuchten die Veränderung des Gangbildes und die Gewebsreaktion des Muskels, der eine Endopeel-Injektion erhielt.
Wir entschieden uns, Endopeel in den vorderen Schienbeinmuskel der Ratten zu applizieren und die histologischen Veränderungen zu untersuchen.
Die Wahl des vorderen Schienbeinmuskels der Ratte erfolgte aufgrund der Gewichtsähnlichkeit mit dem Muskel zum Senken des Mundwinkels beim Menschen.

Ziel : Untersuchung des biologischen Phänomens, das durch die Endopeel-Injektion in den vorderen Schienbeinmuskel der Wistar-Ratte verursacht wird, und Bewertung der Veränderungen im Gangbild sowie der histopathologischen Veränderungen im behandelten Muskel.

Wer sind sie

Autoren

  1. Hauptautoren :  
    -Dr.Alain Tenenbaum
    -Sr.Mauro Tiziani

  2. Tomas Yung Joon Kim
  3. Romulo Mené
Mehr über die Hauptautoren lesen

01

Studien
Gruppe

Experimentatoren : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

N= 29 Wistar-Ratten
Durchschnittsgewicht : 421 g

Herkunft der Tiere : Biotério Central of Campus of Ribeirão Preto of São Paulo University
Pflege : Experimental Pathology Lab of Pathology Department on Medicine School of Ribeirão Preto – USP
Unterbringung der Tiere : polypropylen boxes
Tiernahrung : Standardlabordiät und Wasser
Beleuchtungsbedingungen : natürliche Licht/Dunkel-Zyklen unter kontrollierten Basisbedingungen
Experimentatoren : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

Pathologieabteilung

02

Euthanasie der Tiere & histologische Proben

Konventionelle Mikroskopie

Die Mäuse wurden in CO2-Kammern euthanasiert.

  • Hautinzision mit einer Klinge nº 23
  • Auffinden und Isolieren des vorderen Schienbeinmuskels mit Metzenbaum-Scheren
  • Durchtrennung der Sehnen mit einer Mayo-Schere.
  • Fixierung von Muskelanteilen auf Korkplatten
  • Einbettung unter Verwendung einer 50% Formaldehydlösung - 10% gepuffert und 50% reines Paraffin für die konventionelle optische mikroskopische Untersuchung.
  • Färben der Schnitte als routinemäßiger histologischer Prozess.
  • Mikrotom verwendet : Leika RM 2155
  • Färbung der Muskelschnitte mit

-Hämatoxylin-Eosin
-Masson´s Trichrom
-und rotem Picro-Sirius.

  • Histologische Untersuchung wurde mit einem konventionellen Mikroskop (Olympus BH2) durchgeführt
  • Beobachtung unter polarisiertem Licht
  • Fotodokumentation wurde mit einem Leika DMR-Mikroskop zusammen mit einer digitalen Kamera Leika CD 300F und einem kompatiblen PC durchgeführt.
Mikrotom

03

Material

6 Ratten/Box
  • Die Tiere wurden in 6 Boxen eingeteilt, so dass die Boxen Nr. 1 bis 5 jeweils 5 Ratten und Box Nr. 6 4 Ratten enthielten 
  • Alle Tiere wurden einer Gehbewertung durch Fußabdruck auf speziellem Papier unterzogen, nachdem die Hinterbeine zuvor in eine Seifenlösung eingetaucht worden waren. 
  • Box 1 enthielt die Kontrollgruppe, die die Applikation von 0,1 ml Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) in den rechten vorderen Schienbeinmuskel erhielt. 

  • Die Tiere der Boxen 2 bis 5 erhielten 0,1 ml des Endopeel Originalhauptprodukts in denselben Muskel wie die Kontrollgruppe.

  • Box 6 bestand aus 4 Ratten; jede erhielt 0,5 ml des Endopeel Originalhauptprodukts, injiziert in die subkutane Schicht. 

  • Alle Tiere wurden vor und nach ihren jeweiligen Injektionen einer Gehbewertung unterzogen.

Boxen für Ratten

04

Methoden

Die Tiere werden nach 10 Tagen, 1 Monat, 3 Monaten und 7 Monaten euthanasiert
Euthanasietabelle

Ganganalyse

Um die Fußabdrücke der Ratten zu registrieren, wurden Papierstreifen mit den Maßen 43 cm Länge und 8,7 cm Breite verwendet, Größen, die als für den Catwalk der Ratten geeignet gelten und gemäß der Zeichnung von DE MEDINACELI; FREED; WYATT (1982) gefertigt wurden. Das Papier wurde zuvor in eine Lösung von Bromphenolblau getaucht.

Für die Vorbereitung des Papiers wurde Bromphenolblau in seiner anhydren Form (Sigma) in 1 % in absolutem Aceton gelöst, wodurch eine orange Farbe entstand.
Die Papierbögen wurden in dieser Lösung getränkt und in der Sonne zum Trocknen ausgelegt, anschließend in Streifen geschnitten und in Plastikverpackungen gelagert, um Feuchtigkeit zu vermeiden, die die Blautönung verändern könnte. 

Ganganalyse

Die Tiere wurden über den Catwalk geführt, der mit den zuvor vorbereiteten Papierstreifen ausgelegt war, wobei ihre Hinterbeine in eine Lösung eines neutralen Reinigungsmittels getaucht wurden, was die Farbe des Fußabdrucks sofort von Gelb zu Blau verändert. Die Fußabdrücke blieben auf den Papierstreifen haften, die zum Trocknen ausgelegt wurden, um die notwendigen Messungen zur Berechnung des Sciatic Functional Index vorzunehmen.
Anschließend wurden diese mit einem von SELLI (1998) entwickelten Computerprogramm (Software) analysiert, um den von BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989) vorgeschlagenen Sciatic Functional Index zu erhalten, der die Schrittlänge, die totale Zehenöffnung zwischen der 1. und 4. Zehe sowie die Zwischenzehen (2. und 3.) berücksichtigt. Die Fußabdrücke jedes Tieres wurden vor der Anwendung von Endopeel als Kontrolle, unmittelbar nach der Endopeel-Injektion und erneut in regelmäßigen Abständen erhoben, bis die Tiere für die Entnahme des vorderen Schienbeinmuskels zur histologischen Untersuchung euthanasiert wurden.

Die Fußabdrücke wurden mit einem Scanner digitalisiert und in das SELLI-Programm eingegeben, das die Erfassung, Identifikation und Analyse der Bilder ermöglicht und die Anwendung weiterer Methoden zur Bestimmung des Sciatic Functional Index (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986) sowie des Tibia-Funktionalitätsindex und des Peroneusnervs (BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989) zulässt. Sobald der Fußabdruck auf dem Monitor angezeigt wird, werden seine Parameter analysiert und vermessen; hierzu muss der Cursor in der richtigen, vorgegebenen Reihenfolge an den entsprechenden Stellen platziert werden. Das Programm berechnet dann den Indexwert und speichert diesen ebenfalls im Computer.

Fußabdrücke der Maus ohne Injektion

Fußabdrücke der Maus nach 0,05 ml Injektion in den rechten vorderen Schienbeinmuskel

Berechnung & Messung des Sciatic Functional Index (SFI)

SFI-Berechnung

Schematische Darstellung der Messungen zur Berechnung des Sciatic Functional Index.

E: Experimentell (operierter Fuß);

N: Normal (gegenüberliegender Fuß);

TS: Totale Spreizung der Zehen (1. bis 5.);

IT: Spreizung der mittleren Zehen (2. bis 4.);

PL: Länge des Fußabdrucks

Programm zur Messung des Sciatic Functional Index (SFI)

SFI-Endopeel-Messungen

Ganganalyse

Ganganalyse

Schlussfolgerungen zum Gangbild

  • NaCl 0,9 %, 0,1 ml in den vorderen Schienbeinmuskel verändert das Gangbild nicht.

  • Endopeel in einer Menge von 0,1 ml intramuskulär (pretibial) beeinflusst das Gangbild deutlich unmittelbar nach der Anwendung und mäßig nach 10 bis 30 Tagen.

  • Die durch Endopeel verursachte Gangänderung nimmt über die Zeit ab, wenn es intramuskulär in dieser Konzentration appliziert wird.

  • Die Applikation in das subkutane Gewebe ist nicht so wirksam wie die intramuskuläre Applikation.
  • Wenn 0,5 ml in das subkutane Gewebe (Region des vorderen Schienbeinmuskels) appliziert werden, kommt es zu einem fortschreitenden Verlust des Gangbilds, wahrscheinlich aufgrund der langsamen Diffusion von Endopeel aus dem subkutanen Gewebe in das intramuskuläre.