実験研究

ENDOPEELの筋内投与後の筋組織変化の評価

著者らは、エンドピール注射を受けた筋の歩行変化および組織反応を研究した。
ラットの前脛筋にEndopeelを投与し、組織学的変化を検討することを選んだ。
ラットの前脛筋を選んだのは、重量がヒトの口角の下制筋と類似しているためである。

目的 : ウィスターラットの前脛筋へのEndopeels注射によって引き起こされる生物学的現象を研究し、その歩行の変化および投与筋の組織病理学的変化を評価する。

著者

主な著者 :
-Dr.Alain Tenenbaum
-Sr.Mauro Tiziani
Tomas Yung Joon Kim
Romulo Mené

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01

研究
グループ

実験者：R.Mené、M.Kim、A.Tenenbaum、M.Tiziani

N= 29 ウィスターラット
平均体重：421g

Origin of animals : Biotério Central of Campus of Ribeirão Preto of São Paulo University
Maintenance : Experimental Pathology Lab of Pathology Department on Medicine School of Ribeirão Preto – USP
Animals keeping : polypropylen boxes
Animals food : basic diet of lab and water
Light conditions : 制御された基本的条件下での自然な明暗サイクル
Experimentators : A.Tenenbaum, R.Mené, M.Kim, M.Tiziani

02

動物の安楽死および組織学的サンプル

従来型顕微鏡検査

マウスはCO2室で安楽死処置が行われた。

23号ブレードで皮膚を切開する
Metzenbaum剪刀を用いて前脛筋を同定・剥離する
Mayo剪刀で腱を切離する。
筋の一部をコルク板の切片上に固定する
従来の光学顕微鏡観察のために、50%ホルムアルデヒド溶液 - 10%バッファードと50%の純パラフィンを用いて包埋する。
切片を日常的な組織学的処理により染色する。
Microtome used : Leika RM 2155
筋切片の染色 ：

-ヘマトキシリン・エオシン
-マッソン三色染色
-赤ピクロシリウス.

組織学的検査 は 従来型顕微鏡 (Olympus BH2) を用いて行われた
偏光ランプ下での観察
写真記録 はLeika DMR顕微鏡にデジタルカメラLeika CD 300Fを接続し、対応PCで行われた。

03

材料

6匹/箱

動物は6つの箱に分けられ、1～5番の箱には各5匹、6番の箱には4匹が入っていた。
すべての動物は、特別な紙への足跡印を用いた歩行評価を受け、後肢を石鹸溶液に浸す処置が行われた。
箱1は対照群で、右前脛筋に0,1 ml生理食塩水（NaCl 0,9%）を投与した。
箱2～5のマウスは対照群と同じ筋にEndopeels Original Main Productを0,1 ml投与された。
箱6は4匹で構成され、それぞれ皮下層にEndopeels original main productを0,5 ml注入された。
すべての動物は、それぞれの注射の前後に歩行評価を受けた。

04

方法

動物は10日後、1か月後、3か月後、7か月後に安楽死された

歩行評価

ラットの足跡を記録するために、43 cm長さ×8.7 cm幅の紙片を用いた。これらのサイズはラットのキャットウォークに適すると考えられ、De MEDINACELI; FREED; WYATT (1982) の図に従って作製した。使用する紙はあらかじめブロモフェノールブルー溶液に浸した。

紙の準備では、無水ブロモフェノールブルー（Sigma）を無水アセトンで1%に希釈し、オレンジ色を呈させた。紙片をこの溶液に浸し、日光で乾燥させ、その後、細長く切って湿気で青色が変わるのを防ぐためにプラスチック袋に保管した。

動物は、先に準備した紙片を敷いたキャットウォーク上を歩かせ、後肢を中性洗剤溶液に浸して足跡の色が直ちに黄色から青色に変わるようにした。足跡は紙片に残され、必要な測定を行うために乾燥させた後、坐骨機能指数（Sciatic Functional Index）を算出した。
後にこれらはSELLI（1998）によって開発されたコンピュータプログラム（software）で解析され、BAIN; MACKINNON; HUNTER（1989）が提案した坐骨機能指数が得られた。この指数は、足跡長、第一趾から第四趾までの全趾間距（Total toe spread）、および第二趾と第三趾の中間趾間距（Intermediate toes）を考慮する。各動物の足跡はEndopeel投与前（対照）およびEndopeel注射直後、さらに定期的間隔で、組織学的研究のために前脛筋を摘出する際に採取した。

足跡はスキャナーでデジタル化され、SELLIプログラムに取り込まれた。SELLIは画像のキャプチャ、識別、解析を可能にし、坐骨機能指数の識別のための他の方法（DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984; CARLTON & GOLDBERG, 1986）や脛骨機能指数および腓骨神経に関する指標（BAIN; MACKINNON & HUNTER, 1989）にも適用できる。足跡がモニターに表示されると、そのパラメータが解析・測定され、所定の順序でカーソルを配置してクリックする操作が必要である。プログラムはその後、指数の値を算出して表示し、コンピュータに保存する。